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Toolkit for microbiota research - Researchers cultivate the majority of bacteria in the laboratory that colonize Arabidopsis plants in nature
Werkzeugkasten für die Mikrobiom-Forschung - Forscher kultivieren Großteil der auf Arabidopsis vorkommenden Bakterien

Germany
December 2, 2015

December 02, 2015

No organism is an island - a fact that also applies to plants. Healthy plants host complex microbial communities comprising over 100 bacterial species which presumably play important roles in plant growth and health. Plants allow access only to a select community of bacteria, designated the plant microbiota, that originate mainly from a vast diversity of microorganisms present in natural soil. Researchers from the Max Planck Institute for Plant Breeding Research in Cologne together with scientists in Switzerland cultivated over half of the bacteria found on and in the leaves and roots of the model plant Arabidopsis thaliana (thale cress). Using this representative collection of over 400 bacterial strains in pure culture, the researchers can now reconstitute any microbial community in the leaves and roots of Arabidopsis under laboratory settings. This development marks the beginning of a new era in plant-microbe ecology using defined microbiota.

One aim of the relatively young field of plant microbiota research has been to generate an inventory of plant-associated microbial communities. Paul Schulze-Lefert from the Max Planck Institute for Plant Breeding Research in Cologne and Julia Vorholt from the ETH Zurich and their colleagues have now taken another important step towards this goal. The team cultivated far in excess of half of the bacterial species colonizing leaves and roots of Arabidopsis plants grown in nature and established a collection of bacterial strains with which the leaf and root microbiota can be reconstituted on germ-free plants.

The astonishing similarity between the bacterial communities produced in the laboratory and those found in nature opens the door to microbiota reconstitution biology. The use of such defined communities enables for the first time controlled perturbation of the microbiota under controlled environmental conditions without the vagaries that are inevitable in nature due to environmental fluctuations.

The two scientists cultivated up to 65 percent of the bacterial species found in the root microbiota and up to 54 percent of the species of the leaf microbiota as pure cultures. Yet according to the received wisdom in microbial ecology states, it is not possible to cultivate more than one percent of the bacteria from natural environmental samples. “This is simply incorrect,” says Schulze-Lefert. “We know from our bacterial cultivation efforts that our core culture collection contains the majority of the bacterial species that is present in the communities and provides a very good representation of the taxonomic diversity of the natural leaf and root microbiota. The collection may not be perfect but it provides a very good starting point for microbiota reconstruction experiments,” he adds.

Upon closer inspection of bacterial species profiles, Schulze-Lefert and Vorholt observed a considerable similarity between the microbial communities found in the Arabidopsis leaf and root. “Almost half of the species are identical,” explains Schulze-Lefert. “Despite the fact that the samples for the root microbiota were collected in Cologne and those for the leaf microbiota in Zurich and Tübingen, if you consider the root and leaf microbiota from a higher taxonomic perspective, that is from the level of the bacterial families and classes present, there are no differences at all. So the microbiota are highly robust in different natural environments,” he adds.

The Research Groups determined the genomes of 432 bacterial isolates from their collection by DNA sequencing and compared them. “Not only do we have pure cultures for the reconstitution experiments, we also know the complete genome of each community member in our core collection,” says Schulze-Lefert. The scientists were then able to compare the biochemical capabilities of the leaf and root microbiota. To do this they combined the genes from the genomes with a computer into functional networks. The similarity of the profiles of bacterial species present in the leaf and root communities corresponds to an extensive overlap in functional capabilities encoded by the corresponding genomes. Such experiments are possible today because the biochemical functions of many genes are known, as are the cellular networks and metabolic reactions in which they are involved.

Due to the extensive overlap of genome-encoded functional capabilities and the similarities of the species profiles, Vorholt and Schulze-Lefert concluded that the majority of the leaf- and root-associated bacteria originate from the extraordinarily diverse soil microbiota. This suggests that a plant’s leaves are colonized mainly by soil-derived bacteria via the root as stopover site.

Nevertheless, it is also possible to observe functional differences encoded by the genomes of leaf- and root-associated bacteria. These relate to apparent differences in the ecological niches of the leaf and root. This can be construed, for example, from the bacterial genes needed to feed on complex carbohydrates that are present on leaves and roots; the root microbiota needs fewer of these, as only roots exude large amounts of simple sugars.

The scientists also carried out microbiota reconstitution experiments. To do this, they used a closed artificial environment with sterile clay as a soil substitute, a sterile liquid nutrient medium without organic carbon, and germ-free Arabidopsis seeds. Cultivation was carried out in transparent sterile chambers which were inoculated with defined bacterial communities at different time points. “Although the system is highly artificial, the communities that populate the leaves and roots are remarkably similar to the communities on plants grown in nature,” says Schulze-Lefert.

Even if the defined microbiota inoculum was added to the clay or on leaves alone, the leaf or root microbiota were able to populate not only their corresponding plant organ but, to a considerable extent, also the remotely located leaf and root organ. If the leaf and root microbiota were mixed and then applied to the clay, the root microbiota outcompeted the leaf-derived bacterial community in the root. A corresponding competitive advantage exists for the leaf microbiota in leaves. This points to a specialization of bacterial communities to leaf and root ecological niches despite the extensive functional overlap between the leaf and root microbiota.

The scientists are at an early stage in these microbiota reconstitution experiments. They can now leave out individual bacterial species or entire families from the defined microbiota and test these under different environmental stress conditions. They expect that such controlled perturbation experiments will provide molecular insights into how the bacterial communities mobilize and supply soil nutrients for plant growth and how the microbiota protects its host against microbial pathogens.

Original publication:

Yang Bai et al.

Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota
Nature: DOI 10.1038/nature16192

Werkzeugkasten für die Mikrobiom-Forschung - Forscher kultivieren Großteil der auf Arabidopsis vorkommenden Bakterien

Kein Organismus lebt für sich allein. Auch Pflanzen nicht. Sie beherbergen komplexe mikrobielle Lebensgemeinschaften mit über hundert bakteriellen Arten, die vermutlich für Pflanzenwachstum und Pflanzengesundheit von enormer Bedeutung sind. Dabei gehen die Pflanzen scheinbar zielstrebig vor und gewähren nur einer ausgewählten Gemeinschaft von Mikroorganismen Zutritt. Forscher vom Max-Planck-Institut für Pflanzenzüchtungsforschung in Köln haben zusammen mit Wissenschaftlern aus der Schweiz mehr als die Hälfte der auf Blättern und Wurzeln der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) vorkommenden Bakterien kultiviert. Mit dieser repräsentativen Kollektion von über vierhundert Bakterienstämmen in Reinkultur können die Forscher beliebige mikrobielle Lebensgemeinschaften in den Blättern und Wurzeln von Arabidopsis nachstellen. Damit wird eine neue Ära der Umweltbeobachtung mit definierten Mikrobiomen eingeläutet.

Ziel der noch jungen Mikrobiom-Forschung war bislang eine Inventur der mikrobiellen Lebensgemeinschaften. Paul Schulze-Lefert vom Max-Planck-Institut für Pflanzenzüchtungsforschung in Köln und Julia Vorholt von der ETH Zürich und ihre Kollegen sind jetzt einen gehörigen Schritt weitergegangen. Das Team hat weit mehr als die Hälfte der in der Natur sowie in und auf den Blättern und Wurzeln von Arabidopsis vertretenen Bakterienarten kultiviert und eine Kollektion von Bakterienstämmen angelegt, mit denen die Blatt- und Wurzel-Mikrobiome auf keimfreien Pflanzen nachgestellt werden können.

Die verblüffende Ähnlichkeit der im Labor nachgestellten und in der Natur vorkommenden Lebensgemeinschaften erlaubt den Einstieg in die Rekonstruktion von Mikrobiomen. Mit solchen definierten Lebensgemeinschaften, die dann auch wieder gezielt gestört werden können, ist erstmals eine kontrollierte ökologische Forschung möglich – und zwar ohne die Unwägbarkeiten, die sich in der Natur zwangsläufig durch Fluktuationen von Umweltbedingungen ergeben.

Die beiden Wissenschaftler haben bis zu 65 Prozent der Bakterienarten des Wurzel-Mikrobioms und bis zu 54 Prozent der Arten des Blatt-Mikrobioms in Reinkultur genommen. Dabei besagt ein altes Dogma der mikrobiellen Ökologie, dass nicht einmal ein Prozent der Bakterien aus natürlichen Umweltproben kultivierbar seien „Das ist schlichtweg falsch“, sagt Schulze-Lefert. „Wir wissen durch die systematische Nutzung von bakteriellen Nährmedien, dass unsere Stammkollektion den Großteil der robust in den Lebensgemeinschaften vertretenen Bakterienarten enthält und die taxonomische Vielfalt der natürlichen Blatt- und Wurzel-Mikrobiome sehr gut abbildet. Die Sammlung ist zwar nicht perfekt, aber ein sehr guter Ausgangspunkt für Rekonstruktionsexperimente“, so Schulze-Lefert.

Schulze-Lefert und Vorholt haben beim Artenprofil eine große Ähnlichkeit zwischen den mikrobiellen Lebensgemeinschaften im Arabidopsis-Blatt und in der Arabidopsis-Wurzel festgestellt. „Fast die Hälfte der Arten sind identisch“, erklärt Schulze-Lefert. „Schaut man sich das Wurzel- und Blatt-Mikrobiom von einer höheren taxonomischen Warte an, also von der Ebene der vertretenen bakteriellen Familien und Klassen, sieht man gar keine Unterschiede mehr – obwohl die Proben für das Wurzel-Mikrobiom in Köln und die Proben für das Blatt-Mikrobiom in Zürich und Tübingen gesammelt worden sind. Die Mikrobiome sind also in unterschiedlichen natürlichen Umwelten sehr robust“, so Schulze-Lefert weiter.

Die Arbeitsgruppen haben die Genome von 432 bakteriellen Isolaten aus ihrer Kollektion komplett und in hoher Qualität sequenziert und verglichen. „Damit liegen nicht nur Reinkulturen für die Rekonstitutionsexperimente vor, sondern wir kennen auch das komplette Erbgut jedes einzelnen Isolats in unserer Stammkollektion“, sagt Schulze-Lefert. Nun können die Wissenschaftler die biologische Leistungsfähigkeit des Blatt- und Wurzel-Mikrobioms vergleichen. Dazu haben sie die Gene der sequenzierten Isolate am Computer zu funktionalen Netzwerken zusammengefügt und gegenübergestellt. Die Ähnlichkeit des bakteriellen Artenprofils in den Lebensgemeinschaften von Blatt und Wurzel korrespondiert mit einer ausgeprägten Überlappung in der Leistungsfähigkeit der dazugehörigen Genome. Solche Untersuchungen sind heute möglich, weil man die Aufgaben vieler Gene kennt und weiß, an welchen zellulären Netzwerken und Stoffwechselreaktionen sie beteiligt sind.

Wegen dieser hohen funktionalen Überlappung der Genome und der Ähnlichkeit der Artenprofile nehmen Vorholt und Schulze-Lefert an, dass ein Großteil der Blatt- und Wurzelbakterien ihren Ursprung im außerordentlich diversen Boden-Mikrobiom haben. Die Blätter einer Pflanze werden folglich nicht in erster Linie über Aerosole in der Luft oder über Insekten-assoziierte Mikroorganismen besiedelt, sondern vom Boden aus über die Wurzel als Zwischenstation.

Allerdings lassen sich auch funktionale Unterschiede zwischen den Genomen von Blatt- und Wurzelbakterien feststellen. Diese haben mit den speziellen Aufgaben in den ökologischen Nischen von Blatt und Wurzel zu tun. Das lässt sich zum Beispiel an den Genen für den Stoffwechsel komplexer Kohlenhydrate ablesen, von denen das Wurzel-Mikrobiom weniger braucht als das Blatt-Mikrobiom, weil die Wurzel mehr leicht verwertbaren Zucker ausscheidet als das Blatt.

Die Wissenschaftler haben auch erste Rekonstitutionsexperimente durchgeführt. Dafür nutzen sie eine geschlossene artifizielle Umwelt mit sterilem, gebranntem Ton als Bodenersatz, einem sterilen flüssigen Nährmedium ohne Kohlenstoffquelle und organischen Zusätzen und keimfreies Arabidopsis-Saatgut. Die Anzucht erfolgt in transparenten sterilen Kammern, die zu verschiedenen Zeitpunkten mit genau definierten bakteriellen Lebensgemeinschaften beimpft werden. „Obwohl das System sehr artifiziell ist, sind die Lebensgemeinschaften, die sich an den Blättern und Wurzeln ansiedeln, den natürlichen Lebensgemeinschaften sehr ähnlich“, sagt Schulze-Lefert.

Das Blatt- oder Wurzel-Mikrobiom kann nicht nur sein entsprechendes Pflanzenorgan besiedeln, sondern zu einem erheblichen Anteil auch das jeweils entfernt liegenden Blatt- und Wurzelorgan, wenn nur der Boden oder die Blätter beimpft worden sind. Werden die beiden Mikrobiome zusammen im Boden verwendet, setzt sich das Wurzel-Mikrobiom in der Konkurrenzsituation in der Wurzel gegenüber der Lebensgemeinschaft des Blattes durch. Entsprechend gibt es auch einen Wettbewerbsvorteil für das Blatt-Mikrobiom in Blättern. Das bestätigt einerseits die funktionale Überlappung von Blatt- und Wurzelmikrobiom und gibt gleichzeitig Hinweise auf eine Spezialisierung der beiden bakteriellen Lebensgemeinschaften für die Lebensräume Blatt und Wurzel.

Die Wissenschaftler stehen mit diesen Rekonstruktionsexperimenten erst am Anfang. Sie können jetzt einzelne Bakterienarten oder Familien weglassen, die Umweltbedingungen gezielt verändern oder das System auf andere Weise gezielt stören. Es ist zu erwarten, dass mit solchen Experimenten auch die mutmaßlichen Dienstleistungen der bakteriellen Lebensgemeinschaften für die Nährstoffversorgung und das Wachstum der Pflanze sowie deren Schutzwirkung gegenüber mikrobiellen Krankheitserregern auf molekularer Ebene dingfest gemacht werden können.

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Website: http://www.mpiz-koeln.mpg.de

Published: December 3, 2015